鸟枪克隆法

用于基因组或长DNA链的测序方法。又称鸟枪法、鸟枪测序法、霰弹枪测序法。

先将整个基因组打乱成随机碎片，然后将碎片克隆入载体，随机挑选载体测定每个小片段序列，最终利用计算机对测序结果进行排序和组装，并确定整个基因组序列。由于这种测序方法中切割DNA为随机片段类似于多弹头的鸟枪（又名霰弹猎枪），因此以鸟枪法命名。

原理

诞生于20世纪70年代末，是在英国生物化学家F.桑格发明桑格-库森法后，提出的又一革命性技术。桑格-库森法只能用于100～1000个碱基对的短链DNA，对于较长的序列，需要被细分为可以单独测序的较小片段，克隆入载体进行测序，随后将测序结果重新组装以得到完整序列。长片段DNA测序的一种技术是染色体步移，将长的测序片段分割后，逐段依次测序，每测一段等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移；另一种技术就是鸟枪克隆法，DNA被随机分成许多小段，使用桑格-库森法分别对其进行测序，通过几轮断裂和测序获得靶DNA的多重重叠测序结果，计算机程序利用不同测序片段的重叠末端将它们组装成连续序列。鸟枪法速度快，简单易行，成本较低，但海量测序数据的拼接和组装需要大量的计算和合理的算法，是相对复杂的过程。所以鸟枪法最初多被用于小的微生物基因组的测序。

应用

早期的鸟枪法测序需要首先建立基因组文库，再选择基因组文库中的克隆，进一步片段化、克隆入测序载体，形成亚克隆文库，最终对亚克隆文库进行测序。1995年，美国基因组研究所（TIGR）完成了对流感嗜血杆菌的测序工作，第一次不再使用亚克隆文库，而是直接切割基因组，使其成为非常小的片段（2千碱基对），产生随机鸟枪文库。另外，为了便于组装和填补缺口，同时也构建相对长的片段文库（15～20千碱基对），对大量小片段文库克隆和少量长片段文库克隆进行测序。改进的鸟枪法需要更高数据量的测序，按照传统方法测序流感嗜血杆菌，需构建15个细菌人工染色体（BAC），每个片段长度为200千碱基对，需800个测序反应，总共需要12000个测序反应，而全基因组鸟枪法完成测序需要24000个反应。随后，利用这种改进的鸟枪法，一些病毒的基因组陆续完成，如229千碱基对的巨细胞病毒基因组，186千碱基对的天花病毒基因组。样品制备的自动化和测序技术的快速发展，使全基因组鸟枪法得以发展。

1990年人类基因组计划正式启动，英国、日本、法国、德国、中国和印度先后加入，形成了国际基因组测序联盟。在国际计划中，基因组被分割成多个片段（长度接近150千碱基对），构建为BAC。对每一个片段进行测序前，要先将其定位到每条染色体对应位置，最终将这些片段通过配对末端法及其他许多定位数据重新组装在一起，从而获得完整的基因组，这被称为“分级霰弹枪测序法”。1998年，美国生物学家J.C.文特尔[注]创办了一家名为塞雷拉基因组的公司，开展独立的人类基因组测序。与人类基因组计划相比，他一改传统的物理图测序方法，采用全基因组鸟枪法测序，并且没有使用附加的定位拼接，省却了费事费力地制备物理图的过程，因此大大加快了测序的时间周期，以更快的速度和更少的投资（3亿美元，仅为人类基因组计划的1/10）来完成此项工程。因为塞雷拉基因组的竞争，促使人类基因组计划不得不改进其策略，进一步加速其工作进程，使得该计划得以提前完成。

发展前景

经典的鸟枪克隆法基于桑格-库森法。现在的基因组测序项目通常由专业的测序公司来完成，新一代测序技术层出不穷，各有特点，测序成本不断降低，在非常短的时间内测序数据量达十万或数百万。但是这些技术中产生的每个反应读长较短（25～500碱基对），最长仍不超过900碱基对，所以鸟枪克隆法仍是通常的选择方案。鸟枪克隆法与新一代测序技术及序列组装软件的结合，可以以更短的时间来完成整个基因组的测序，不断刷新基因组测序速度和成本的纪录。